BASES ET PERSPECTIVES DE LA CYTOGENETIQUE HUMAINE

 

 

L'ADN est le constituant génétique essentiel des cellules transmettant l'information sous forme codée de cellule à cellule et d'organisme à organisme. A l'intérieur des cellules, le DNA n'est pas libre mais forme un complexe avec des protéines spécifiques, l'ensemble formant la chromatine. Le noyau contient une quantité constante d'ADN, représentant le matériel génétique. L'information génétique reste inchangée durant la différentiation des tissus somatiques. Cette situation est dûe a un nombre de chromosome constant dans les cellules somatiques; ce nombre de chromosomes est de 46 (2n).

 

BASES HISTORIQUES DE LA CYTOGENETIQUE HUMAINE

La cytogénétique, pratiquement née avec le vingtième siècle, est une discipline jeune. Les progrès les plus récents ont amené la transformation des méthodes et l'élargissement des applications. La connaissance de l'organisation des chromosomes a permis de rendre compte des particularités et des variations de l'ADN constitutif. A l'heure actuelle, l'apport cytogénétique est devenu indispensable à plusieurs pathologies humaines.

Il y a de nombreuses façons d'approcher l'histoire de la cytogénétique humaine. T.C. Hsu définit 4 périodes (Hsu, 1979). La première période (1891-1952) ou "âge des Ténèbres de la Cytogénétique Humaine" débute par le travail d'un cytologiste D. von Hanseman qui en 1891, dénombre le premier 18, 24 et plus de 40 chromosomes dans 3 cellules de tissu humain normal. Ces premières, puis d'autres observations donnent lieu à des estimations contradictoires du nombre des chromosomes. En 1910, Branca définit le nombre somatique normal à 48 chromosomes. Tous ces auteurs ont utilisé des techniques d'histologie classique sur des prélévements post-mortem de testicule humain. Les comptages des chromosomes étaient difficiles par la superposition des images et la perte d'un ou de plusieurs chromosomes. En 1912, Winiwarter améliore cette technique en prenant des biopsies de testicules prélévées chirurgicalement, immédiatement fixées et coupées à une épaisseur de 5 à 7,5 mm qui permettent de garder intact l'ensemble de la garniture chromosomique. A la suite de ces améliorations techniques, Winiwarter conclut à la présence de 47 chromosomes dans les spermatogonies (46A+X) et de 48 (46A+X+X) dans les ovogonies et à un mécanisme du déterminisme du sexe à XX/XO. Le chromosome Y est décrit plus tard par Painter (1921,1922) comme un élément petit et non apparié et conclut en 1923 à l'existence de 46A+X+Y pour l'homme et à 46A+X+X pour la femme et à un mécanisme du déterminisme du sexe liée à la formule XX ou XY (Painter, 1923).

La deuxième période (1952-1959) de la cytogénétique commence avec la découverte fortuite, en 1952, par Hsu, du prétraitement par le choc hypotonique des préparations chromosomiques obtenues in vitro à partir de cellules de tissu splénique. Cette nouvelle technique favorise le gonflement cellulaire, la dispersion des chromosomes et permet une meilleure individualisation de ceux-ci. A la suite de cette découverte, deux cytologistes Albert Levan et Joe Hin Tjio, en 1956, déterminent le nombre de 46 chromosomes dans les cellules somatiques humaines. Cette découverte est à la base de l'étude systématique du caryotype humain.

La troisième période (1959-1969) commence par la publication le 26 janvier 1959 par Lejeune, Gauthier et Turpin dans les Compte-Rendus de l'Académie des Sciences (Paris) de la présence chez neuf enfants mongoliens d'un petit chromosome acrocentrique surnuméraire. Cette découverte marque la naissance de la "Cytogénétique Clinique". Depuis cette date, l'importance diagnostique de la cytogénétique n'a cessé de croître. Un effort collectif des cytogénéticiens et des cliniciens pour rechercher dans les anomalies congénitales une éventuelle étiologie chromosomique fait suite à cette découverte. Rapidement, différentes anomalies de nombre et de structure chromosomiques sont décrites : le syndrome de Klinefelter (47,XXY) par Jacobs et Strong (1959), la monosomie du syndrome de Turner (45,X) par Ford et coll., (1959), le syndrome triple-X par Jacobs et coll. (1959), la trisomie 13 par Patau et coll (1960), la trisomie 18 par Edwards et coll (1960), la polyploïdie par Böök et Santesson (1960), la délétion du bras court du chromosome 5 de la maladie du cri-de-chat par Lejeune et coll (1963). Carr (1963) établit que des anomalies chromosomiques peuvent être à l'origine d'avortements spontanés. Cet essor de la cytogénétique humaine révèle la grande fréquence des aberrations chromosomiques chez l'Homme. Les données cumulatives montrent que les chromosomes humains sont instables, que les anomalies chromosomiques trouvées par les cytogénéticiens des plantes et des insectes surviennent spontanément dans les populations humaines avec une fréquence importante. En 1960, Peter Nowell a l'idée d'utiliser la phytohémagglutinine pour l'étude des cellules sanguines. Cette substance capable d'une action mitogène sur les lymphocytes induit leur transformation blastique et dès lors, permet l'étude du caryotype à partir d'un simple prélèvement de quelques millilitres de sang périphérique.

La quatrième période de la cytogénétique (après 1969) est celle du banding chromosomique. La première technique de banding est dûe à Caspersson, qui utilise la moutarde de quinacrine pour individualiser chaque chromosome par l'apparition de bandes caractéristiques : les bandes Q (Caspersson, 1969, 1970). D'autres techniques sont rapidement mises au point : banding G (Seabright, 1971), banding R (Dutrillaux et Lejeune, 1971), banding C (Sumner et al., 1971), banding NOR (Howell et al., 1975). La découverte des bandes chromosomiques va améliorer considérablement les potentialités d'analyse et permet la reconnaissance plus aisée de délétions, translocations, inversions, localisations de points de cassures, caractérisation des centromères et de la nature hétérochromatique des certains segments chromosomiques qui n'étaient pas évidentes auparavant. Les techniques de banding usuels RHG ou GTG permettent de définir 300 à 400 bandes par génome haploïde avec une résolution d'environ 7 à 10x106 pb par bande. De nombreuses délétions, duplications et translocations peuvent être détectées à ce niveau de résolution. La technique de "haute résolution", mise au point par Yunis en 1976, permet encore d'améliorer la définition cytogénétique des chromosomes. Les techniques en haute résolution de 500 à 2000 bandes par génôme haploïde avec une résolution d'environ 1 à 5x106 pb par bande permettent maintenant la détection des microdélétions et microduplications. Elles ont conduit à la description d'une nouvelle pathologie chromosomique : les syndromes de microdélétions et microduplications (Ledbetter, 1989). Il faut souligner que 1.106 pb est équivalent à 1 centimorgan et par conséquent cette technologie fine rapproche les résultats de la cytogénétique de ceux de la génétique formelle et moléculaire. Plus récemment enfin, d'autres techniques ont fait leur apparition et deviennent de plus en plus couramment utilisées. L'hybridation in situ a fait appel d'abord à des sondes radioactives (Gall et Pardue, 1969) puis à des sondes froides fluorescentes dans la technique FISH. Cette technique permet soit à l'aide de sondes à motifs répétés soit de sondes géniques de rechercher des anomalies chromosomiques ou des anomalies géniques. Elle est particulièrement utile pour la détection des anomalies chromosomiques submicroscopiques. Elle est très spécifique d'un fragment de chromosome ou d'un gène. Le chromosome painting ou "peinture chromosomique" utilise des sondes spécifiques d'un ou de plusieurs chromosomes et révèle des anomalies de structure non détectables par les autres techniques. Le développement de ces techniques récentes a fait passer la cytogénétique de l'étude des cellules en division (prométaphase, métaphase) à l'étude des cellules pendant l'interphase.

 

STRUCTURE ET ULTRASTRUCTURE DU CHROMOSOME

1) Structure du Chromosome (figure 1)

Un chromosome est formé d'une longue molécule d'ADN unique. Chaque molécule d'ADN formant un chromosome possède un centromère, deux télomères et des origines de réplication.

Centromère : Cet élément permet d'attacher la molécule d'ADN au fuseau mitotique pendant la mitose.

Télomères : Ce sont des éléments de séquence d'ADN particuliers à chaque extrémité d'un chromosome linéaire. La réplication sur le brin précoce d'une fourche de réplication nécessite la présence d'ADN en avant de la séquence à copier et qui servira de matrice pour une amorce d'ARN. Puis qu'il ne peut jamais y avoir une telle matrice pour les quelques derniers nucléotides d'ADN linéaire, chaque chaîne d'ADN se raccourcirait à chaque cycle de replication s'il n'y avait un système particulier compensant cette perte. Les cellules eucaryotes possèdent une séquence d'ADN télomérique particulière au niveau de chaque extrémité du chromosome. Celle-ci est allongée périodiquement à chaque cycle de réplication par un enzyme particulière, compensant ainsi la perte de quelques nucléotides de l'ADN télomérique.

Origines de réplication : Pour qu'une molécule d'ADN forme un chromosome fonctionnel, elle doit être capable de se répliquer, de séparer ses deux copies à la mitose et de se conserver d'une génération cellulaire à l'autre. La molécule d'ADN a besoin d'une séquence nucléotidique particulière qui initie sa réplication.

2) Ultrastructure du Chromosome (figure 2, figure 3)

Chaque chromosome est formé d'une molécule d'ADN et de protéines liées à cet ADN.

L'ADN : est composé d'acides désoxyribonucléiques formant une double hélice.

Les protéines : sont de deux types : histones et non histones.

Les protéines histones : Ces protéines sont présentes dans le noyau en proportions constantes par rapport au DNA, et constituent les principales protéines de structure des chromosomes eucaryotes. Elles sont présentes en quantités si importantes que leur masse totale dans la chromatine avoisine celle de l'ADN. Les histones sont des protéines relativement petites, contenant une très forte proportion d'acides aminés chargés positivement (lysine et arginine). Cette charge positive permet aux histones de se lier fortement à l'ADN (chargé négativement, indépendamment de sa séquence).

Il existe cinq types d'histones, divisés en deux groupes principaux : 1) les histones nucléosomiques et 2) les histones H1.

Les histones nucléosomiques sont de petites protéines (102 à 135 résidus d'acides aminés) responsables de l'enroulement de l'ADN dans les nucléosomes. Ces quatre histones sont appelées H2A, H2B, H3 et H4.

Les histones H1 sont plus volumineuses (environ 220 acides aminés) et présentes sous forme de six variétés, différant légèrement dans leur séquence d'acides aminés.

Le nucléosome est l'unité fondamentale d'empaquetage de la chromatine. Un traitement par les nucléases peut débobiner cet empaquetage très ordonné de la chromatine. A la suite de ce traitement, la chromatine apparaît en microscopie électronique comme un "collier de perles". Les "perles" ou nucléosomes forment des disques d'un diamètre d'environ 11 nm, constitués de 2 copies de chacune des 4 histones nucléosomiques pour former un octamère d'histones. Il forme le noyau protéique autour duquel l'hélice d'ADN bicaténaire est enroulée deux fois. Ces fragments d'ADN bicaténaires sont longs de 146 paires de nucléotides. L'ADN s'étend comme un fil continu allant de nucléosome en nucléosome. Chaque nucléosome est séparé du suivant par un segment d'ADN internucléosomique dont la longueur peut varier de 0 à 80 paires de nucléotides. En moyenne, les nucléosomes se répètent environ toutes les 200 paires de nucléotides.

Les nucléosomes sont habituellement empilés pour former des structures régulières d'ordre supérieur. Les histones H1 participent à l'empilement de nucléosomes dans la fibre de 30 nm.

Les protéines non histones : Les chromosomes contiennent une variété de protéines liées à des séquences spécifiques d'ADN. Les protéines non-histones sont hétérogènes et varient d'un tissu à l'autre. L'information stockée dans l'ADN est organisée, répliquée et lue par une variété de protéines de liaison à l'ADN.

 

Les chromosomes mitotiques sont formés de chromatine dans son état le plus condensé. Au cours de la mitose les chromosomes se condensent et s'enroulent (ainsi un DNA de 5 cm peut aboutir dans un état condensé à 5 mm). Cette condensation se fait grâce à des phénomènes de phosphorylation. L'histone H1 subit une phosphorylation sur ses 5 résidus sérine. Au stade métaphasique de la mitose, les deux nouvelles molécules d'ADN sont repliées séparément pour donner deux chromosomes identiques (appelés chromatides soeurs), maintenus ensemble au niveau de leurs centromères. En microscopie électronique, il est possible d'observer que chaque chromatide est organisée en boucles de chromatine partant d'un axe central.

Pendant l'interphase les chromosomes sont suffisamment étendus, fins et enchévêtrés pour que leurs boucles soient facilement observables en ultrastructure.

NOMENCLATURE (figure 4)

La classification des chromosomes est fondée sur leurs caractères morphologiques (taille, indice centromérique, répartition des différentes bandes). Leur nomenclature a évolué parallèlement à l'amélioration des techniques et son établissement a fait l'objet de plusieurs réunions internationales de standardisation (Denver 1970, Londres 1963, Chicago 1966, Paris 1971, Stockholm 1977).

De façon générale, les autosomes sont classés dans un ordre de taille décroissante et numérotés de 1 à 22. Les gonosomes, ou chromosomes sexuels, sont les chromosomes X et Y. La formule chromosomique est : 46,XX chez la femme et 46,XY chez l'homme.

Les bras chromosomiques sont désignés respectivement par p pour le bras court et q pour le bras long.

Ces chromosomes sont classés en 7 groupes, en fonction de leur taille et de la position du centromère :

-groupe A : chromosomes 1 à 3

-groupe B : chromosomes 4 et 5

-groupe C : chromosomes 6 à 12 et chromosome X

-groupe D : chromosomes 13 à 15

-groupe E : chromosomes 16 à 18

-groupe F : chromosomes 19 et 20

-groupe G : chromosomes 21, 22 et chromosome Y.

Les techniques de banding chromosomique permettent de caractériser chaque chromosome par la présence de bandes. Chaque bande est définie comme une partie de chromosome distinguable des segments adjacents par l'apparition de segments plus sombres ou plus claires à l'aide d'une ou plusieurs techniques de banding. Une bande paraissant sombre avec une technique donnée peut appraître claire avec une autre technique.

Les techniques de banding sont de deux types :

-celles produisant des bandes sur toute la longueur des chromosomes : bandes Q, G et R

-celles qui ne marquent spécifiquement d'un nombre réduit de structures : bandes C, NOR.

PERSPECTIVES DE LA CYTOGENETIQUE HUMAINE

Actuellement, la cytogénétique apparaît comme une science à part entière. Plusieurs "spécialités" se sont dévéloppées : 1) la cytogénétique clinique, 2) la cytogénétique constitutionnelle, 3) la cytogénétique prénatale, 4) la cytogénétique hématologique, 5) la cytogénétique des cancers solides.

Malgré tous les progrès acquis, la cytogénétique reste une technique artisanale, soumise aux aléas de la culture cellulaire. Au plan de la recherche fondamentale, la cytogénétique a pris une importance capitale depuis le développement de la génétique inverse. La génétique classique permettait d'aboutir à un gène à partir de l'individualisation d'une protéine, comme ce fut le cas pour les gènes des hémogloblinopathies. La découverte d'une translocation t(X;21) chez un sujet atteint d'une myopathie de Duchenne a modifié la stratégie de recherche des gènes.

La cytogénétique contribue pour une large part à la constitution de la Carte Génétique de l'Homme par l'étude de recombinaisons, de localisations précises des points de cassure, des modalités de réarrangements et de la confrontation avec les phénotypes correspondants. D'autre part, dans le Programme de Recherche sur le Génôme Humain, l'individualisation des Yacs chimériques se fait par des techniques utilisant l'hybridation in situ et la cytogénétique classique.

L'apport de la cytogénétique au domaine de la cancérologie reste très important. Dès 1914, Boveri avait avancé l'hypothèse que des changements dans la constitution chromosomique constituaient un prérequis à l'apparition d'un cancer. Nowell et Hungerford en 1960 découvrent le chromosome Philadelphie ou t(9;22) et montrent qu'une translocation spontanée peut survenir entre 2 chromosomes de façon indépendante et répétée. La découverte d'autres anomalies spécifiques va suivre. Les différentes anomalies cytogénétiques trouvées dans les hémopathies sont à l'origine de la découverte des oncogènes. Dans ce domaine d'anomalies cytogénétiques acquises, la cytogénétique classique joue un rôle très important dans le diagnostic et le pronostic de ces affections. Les techniques en cytogénétique hématologique ont fait beaucoup de progrès. L'hybridation in situ comparative ou comparative genomic hybridation utilise le marquage par deux sondes de couleurs différentes des chromosomes d'un patient et d'un témoin normal et permet la détection des délétions et des duplications passées inaperçues par des techniques classiques.

Enfin, le rôle de la cytogénétique reste fondamental dans la recherche de différentes localisations géniques, dans l'étude des gènes du déterminisme génétique du sexe et dans l'étude des fragilités chromosomiques à l'origine de la découverte des mutations instables.